Методический материал

№п/п

Санитарно-микробиологический показатель

Методика проведения анализа

1

Определение колифагов в питьевой воде

Прямой метод определения колифагов.

Определение колифагов в питьевой воде заключается в исследовании нормируемого объема воды (100 мл) путем его прямого посева и последующего учета зон лизиса (бляшек) на газоне E.coli в чашках Петри с питательным агаром.

В питательный агар двойной концентрации (п. 5.3.2), расплавленный и остуженный до 45 - 49 °C, добавить смыв E.coli (п. 8.5.2.3) из расчета 2,0 мл смыва (или 4 мл 4-часовой бульонной культуры) на каждые 100 мл агара, перемешать. Исследуемые 100 мл воды разлить по 20 мл в большие пробирки, нагреть до 35 - 44 °C и немедленно (не более чем через 5 мин. по достижении требуемой температуры) разлить в 5 чашек Петри и сразу же внести в каждую чашку по 20 мл смеси агара с культурой E.coli.

Для контроля культуры E.coli в одну чашку Петри внести 20 мл стерильной водопроводной воды, предварительно прогретой до 35 - 44 °C, залить 20 мл приготовленного агара с E.coli и осторожно перемешать.

Содержимое чашек осторожно перемешать и оставить при комнатной температуре до застывания. Чашки с застывшим агаром поместить дном вверх в термостат и инкубировать при температуре 37 +/- 1 °C в течение 18 +/- 2 ч.

Учет результатов

Просмотр посевов осуществляется в проходящем свете.

Учет результатов проводят путем подсчета и суммирования бляшек, выросших на 5 чашках Петри. Результаты выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 100 мл пробы воды. В контрольной чашке бляшки должны отсутствовать.

Наиболее часто зоны лизиса выглядят прозрачными пятнами на фоне газона тест-культуры питательного агара в виде круглых изолированных бляшек (от 1 до 5 - 7) мм в диаметре с четко выраженными либо стертыми границами.

При высоких концентрациях фага наблюдается разная картина лизиса.

Слияние негативных колоний дает "ажурный" газон E.coli, рост единичных колоний E.coli на фоне сплошного лизиса либо полное отсутствие роста на чашке.

При прямом посеве возможен лизис, маскируемый негомогенно застывшим агаром, а также закрытый сопутствующей микрофлорой. Капли конденсата и негомогенно застывший при прямом посеве агар могут приводить к образованию артефактов на газоне E.coli, визуально напоминающих лизис.

Предварительный учет результатов можно проводить через 5 - 6 ч инкубации. На этом этапе при наличии четких зон лизиса может быть выдан предварительный ответ о присутствии колифагов в воде.

Окончательный количественный учет прямого посева проводится через 18 +/- 2 ч. Результаты выражают количеством бляшкообразующих единиц (БОЕ) на 100 мл пробы воды.

Если отмечен сливной рост бляшек и счет затруднителен, то по данным прямого посева может быть выдан качественный результат: "обнаружено в 100 мл воды".

2

Проведение качественного анализа воды

 Определение микробного числа воды. Предполагает исследование общего количества мезофильных аэробов и факультативных анаэробов в 1мл. исследуемой воды, способных при 37 ºС в течение 24 часов образовывать на МПА колонии, видимые невооруженным глазом и при увеличении в 2-5 раз. В зависимости от степени загрязнения воды готовят последовательно ее 10-кратные разведения от 1:10 для чистых до 1:10000 для сильнозагрязненных сточных вод. При исследовании водопроводной воды в каждую из двух чашек вносят по 1мл. неразведенной воды и заливают 10-12 мл растопленного и остуженного до 45 ºС МПА, а для выявления роста грибов – сусло-агара. Посевы на МПА выращивают в течение суток при 37 ºС, а на сусло-агаре – 2-3 суток при 27 ºС. Учет колоний производится с использованием лупы, на чашках, где выросло не более 300 колоний. Микробное число питьевой воды централизованного водоснабжения не должно превышать 100 микробных клеток в 1 мл.

3

Определение стафилококков в воздухе

 Для определения стафилококков в воздухе используют седиментационный метод, при котором чашки Петри с элективными средами без крышек помещают на горизонтальные поверхности и выдерживают установленное время:

10–30 мин — чашки с мясопептонным агаром для определения общего числа микроорганизмов;

15 мин — чашки с желточно-солевым агаром для выявления стафилококков;

до 2 ч — для выделения грамотрицательных неферментирующих бактерий.

В месте забора используют не менее 2 чашек с одной питательной средой. После экспозиции чашки закрывают, переворачивают, помещают в термостат и инкубируют при температуре 37±1 °С в течение 24±2 ч.

После инкубации проводят учёт количества колоний выросших микроорганизмов и при необходимости идентификацию микроорганизмов до рода и вида.

4

Определение патогенных микроорганизмов в воздухе

Определение патогенных микроорганизмов в воздухе.

Ввиду малой концентрации патогенных микроорганизмов в воздухе закрытых помещений, их выделение является достаточно трудной задачей.

При расшифровке внутрибольничных инфекций определяют в воздухе присутствие стафилококков, стрептококков, синегнойной палочки, сальмонелл, протеев и др. Отбор проб воздуха производят в объеме не менее 1000 л. Посев производят на соответствующие элективные среды. Если используется жидкая среда как улавливающая жидкость, то пробирку с жидкостью помещают в термостат на сутки для подращивания (получение накопительной культуры), а затем высевают на элективную среду.

При исследовании воздуха на наличие микобактерий туберкулеза отбор проб производят в объеме 250—500 л воздуха. В качестве улавливающей жидкости берут среду Школьниковой, которую затем обрабатывают 3% раствором серной кислоты (для подавления сопутствующей микрофлоры) и центрифугируют. Осадок засевают в пробирки на одну из яичных сред, чаще среду Левенштейна - Иенсена. Инкубируют при 37°С до 3 мес. Отсутствие роста в течение 3 мес дает возможность выдать отрицательный ответ. Пробирки первый раз просматривают через 3 нед, затем каждые 10 дней. Выделенную культуру идентифицируют, определяют ее вирулентность (заражением морских свинок - биопроба) и при необходимости определяют устойчивость к лекарственным препаратам.

5

Качественно-количественный метод определения токсичности почв

 В стерильную чашку Петри также вносится 10 г почвы и распределяется равномерно по всей поверхности, затем, как и при качественном методе, вносится непитательный и питательный агар. В качестве дополнительного барьера между почвой и индикаторным штаммом на поверхности питательной среды укладывают мембранный фильтр.

На матовую поверхность мембранных фильтров простым карандашом наносятся 16 точек, после чего фильтр стерилизуют кипячением. Затем на питательную среду помещают мембранные фильтры (матовой поверхностью вверх) в количестве от 1 до 4-х на одну чашку. На поверхность фильтра в местах, отмеченных точками, производят посев бактериальной петлей (иглой) культуры индикаторного штамма, суспензированного в физиологическом растворе, содержащем около 100 млн. бактериальных клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности. Эта манипуляция упрощается при использовании специального штампа в виде металлического диска диаметром около 30 мм. В диск вмонтированы 16 стальных игл строго одинаковой длины и толщины. Культуры микроорганизмов наливают в чашки Петри и погружают в них кончики игл стерильного штампа, а затем одновременно производится посев в 16 точках мембранного фильтра. Посевы инкубируют в термостате или анаэростате при оптимальной температуре и продолжительности в зависимости от физиологических особенностей индикаторного штамма.

Учет результатов производят путем подсчета выросших колоний в точках посева. Процент пророста (Р) высчитывается как количество образовавшихся колоний к количеству посевов. Токсичность определяется по формуле: Т = 100 - Р. Этим методом, как и качественным, устанавливается абсолютная токсичность, когда на фильтрах не вырастает ни одна колония; отсутствие токсичности - на метах всех посевов вырастают колонии и различная степень токсичности - когда прорастает только часть засеянных точек.