Микробиологические исследования почвы

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

ЛУГАНСКОЙ НАРОДНОЙ РЕСПУБЛИКИ

Стахановский филиал ГОСУДАРСТВЕННОГО УЧРЕЖДЕНИЯ ЛУГАНСКОЙ

НАРОДНОЙ РЕСПУБЛИКИ «ЛУГАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ СВЯТИТЕЛЯ ЛУКИ»

«Стахановский медицинский колледж»

(СтФ ГУ ЛНР «ЛГМУ ИМ.СВЯТИТЕЛЯ ЛУКИ» «Стахановский МК»)

Алгоритм лабораторных микробиологических исследований почвы.

Учебное пособие для организации аудиторной и внеаудиторной самостоятельной работы по МДК 04.01 Проведение лабораторных микробиологических исследований

Специальность 31.02.03 Лабораторная диагностика

Стаханов 2022

Пояснительная записка

Один из основных принципов здравоохранения является профилактика, еще Н.И. Пирогов говорил: «Будущее принадлежит медицине предупредительной».

Основной задачей санитарной микробиологии является предупреждение возникновения инфекционных заболеваний, что достигается изучением экологии микроорганизмов, разработкой практических мероприятий по организации борьбы с инфекционными заболеваниями.

Для этого необходимо выделить патогенные микроорганизмы внешней среды: воды, почвы, воздуха.

Занимается этим бактериологическая лаборатория санитарной станции.

Работу по исследованию выполняют фельдшера лаборанты под руководством врача бактериолога.

Для проведения санитарно-микробиологических исследований существуют специальные государственные стандарты – ГОСТы, или методические указания по выполнению исследований из окружающей среды.

В данной работе представлены алгоритмы исследований воздуха, воды и смывов почвы, т.е. поэтапное определение патогенных возбудителей в воздухе, воде и смывов почвы.

Это облегчает работу по проведению исследований. Выделение чистой культуры кишечной и воздушно-капельной групп студенты изучили на предыдущих курсах по МДК 04.01.

Изучая санитарную бактериологию, студенты используют полученные раньше знания, для исследования воды, почвы, смывов, воздуха и работают по алгоритму исследования воды, почвы, смывов и воздуха.

Тема «Санитарная бактериология почвы»

Санитарная бактериология занимается изучением микроорганизмов и процессов ими вызываемых в окружающей среде (вода, почва, воздух, пищевые продукты). Человек, живущий в окружающей среде, является неотъемлемой частью этих процессов, так как именно в его организме могут проходить процессы жизнедеятельности микроорганизмов и вызывать патологические изменения, то есть заболевания. Поэтому существует санитарная бактериология воды, почвы, воздуха, пищевых продуктов.

Цель занятия: Основной задачей санитарной микробиологии является предупреждение возникновения инфекционных заболеваний, что достигается изучением экологии микроорганизмов, разработкой практических мероприятий по борьбе с инфекционными болезнями.

Непосредственное выявление патогенных микроорганизмов во внешней среде представляет значительные трудности, так как они встречаются в ней постоянно и в малых количествах. Поэтому пользуются косвенными показателями зараженности окружающей среды – выявлением санитарно-показательных микроорганизмов.

Санитарно-показательными микроорганизмами являются постоянные обитатели поверхностей и полостей тела человека и животных, выделяющиеся з организма теми же путями, что и патогенные микроорганизмы. Поэтому, чем больше выявлено санитарно-показательных микроорганизмов, тем большая вероятность попадания в объекты внешней среды патогенных микроорганизмов.

Для каждого объекта внешней среды имеются определенные санитарно-показательные микроорганизмы – критерии оценки по бактериологическим показателям. Например, в отношении кишечных инфекций роль таких индикаторов принадлежит кишечным палочкам – постоянным обитателям кишечника человека и животных.

Для проведения санитарно-микробиологических исследований существуют специальные государственные общесоюзные стандарты – ГОСТы или методические указания, которые позволяют дать оценку соответствия выявленной в окружающей среде микрофлоры гигиеническим требованиям.

ГОСТы или методические указания предусматривают:

1. Правила отбора проб.

2. Количество взятого материала.

3. Условия транспортировки.

4. Методы исследования.

5. Цель исследования.

6. Критерии оценки полученных результатов.

К каждой отобранной пробе прилагают сопроводительный документ с указанием:

1. Название пробы (вода, почва, пищевые продукты и т. д).

2. Место взятия пробы и номер.

3. Дата (число, месяц, год, время).

4. Цель исследования.

5. Куда направляется проба для исследования.

6. Подпись лица, взявшего пробу.

Примечание. В некоторых случаях, например, при исследовании водных источников, почвы, отмечают метеорологические условия в момент взятия пробы.

Транспортировка отобранных проб всегда производится при температуре не выше 6 – 8⁰ С, чтобы не было размножения и гибели микроорганизмов. Такую температуру поддерживают с помощью резиновых мешков, зимой наполненных теплой водой, летом – льдом. Для перевозки и хранения взятых проб лучше пользоваться сумками-холодильниками или контейнерами со льдом.

В лаборатории полученные пробы регистрируют в журналах. Бактериологическое исследование должно проводиться не позднее 3 – 6 часов от момента взятия материала.

САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ

ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЧВЫ

Алгоритм исследования.

Почва является основным местом обитания многих микроорганизмов. Из почвы микробы поступают в воду и обсеменяют воздух.

Микробиологическое исследование почвы имеет важное значение. Оно проводится при выборе участка для строительства детских учреждений, спортивных площадок, больниц, госпиталей, военных лагерей, водопроводных сооружений и других объектов.

Санитарно-микробиологический анализ почвы включает определение:

• общего количества бактерий в 1 г почвы;

• титра санитарно-показательных микроорганизмов БГКП и С. perfringens;

• термофильных бактерий в 1 г почвы;

• по эпидемиологическим показаниям проводится исследование на наличие патогенных микроорганизмов (сальмонелл, шигелл, клостридий столбняка, ботулизма, некоторых вирусов и др.).

Отбор проб почвы. Выбор места для отбора проб почвы определяется санитарным врачом и бактериологом в зависимости от цели и задачи исследования. На обследуемой территории до 1000 м² выделяют два участка площадью 25 м^2. Один должен быть расположен близ источников загрязнения (свалки, мусорные ящики, выгребные ямы и т. д.), другой - в отдалении от них (контроль). На каждом участке в 25 м² намечают для отбора проб пять точек: четыре по углам и одна в центре или пять точек по диагонали участка.

Для исследования поверхностного слоя почвы пробы отбирают стерильной лопаткой или совком на глубине до 20 см. Из отдельных точек участка лопаткой выкапывают цельный кусок почвы. Стерильным ножом снимают верхний слой толщиной 1,5 – 2,0 см и из середины куска набирают стерильной ложкой 200 – 300 г почвы. Смешанный образец, составленный из пяти отдельно взятых проб почвы, должен весить не менее 1 кг.

При исследовании образцов из глубинных слоев почвы (от 0,75 до 2 м) пользуются специальным буром с полостью. На заданной глубине полость бура открывается, наполняется почвой, затем механически закрывается, и бур извлекают на поверхность.

Пробы почвы, взятые для анализа, переносят в стерильные банки с ватно-марлевыми пробками и покрывают стерильной пергаментной бумагой. К каждой банке приклеивают этикетку с указанием даты и номера пробы. В сопроводительном документе отмечают характер почвы, расположение источников загрязнения, площадь обследуемой территории, данные, характеризующие климат местности и т. п.

Все пробы помещают в деревянный ящик с гнездами и немедленно транспортируют в лабораторию. Если нет возможности приступить к исследованию почвы в тот же день, то допускается хранение проб в холодильнике при 1 – 2 С⁰ в течение суток.

Подготовка проб почвы к исследованию. Образцы почвы, отобранные на одном участке из некоторых точек, хорошо перемешивают, освобождают от крупных включений (щебня, камней, корней, стекол). От среднего образца отделяют 200 – 300 г и вносят в стерильную посуду. Затем почву дробят в стерильной ступке, просеивают через стерильное сито на стерильную бумагу и берут для исследования навеску в 30 г. Навеску почвы высыпают в стерильную колбу вместимостью 500 мл и доливают 270 мл стерильной водопроводной воды, получают разведение почвы 1:10. Взбалтывают почвенную взвесь 10 – 15 мин и из приготовленного разведения 1:10 без отстаивания готовят ряд последовательных десятикратных разведений по общепринятой методике. При анализе чистых почв ограничиваются 3 – 4 разведениями (до 1:1000, 1:10.000), при исследовании загрязненных почв используют разведения - до 1:100.000, 1: 1.000.000.

Определение общего количества бактерий в почве проводят аналогично исследованию воды. Показатели общего количества бактерий для различных видов почв представлены в таблице.

Определение БГКП

Определение БГКП как показателя фекального загрязнения проводят двумя методами: титрационным и методом мембранных фильтров.

ТИТРАЦИОННЫЙ МЕТОД

Первый день исследования

Из первоначального разведения почвенной взвеси 1:10 стерильной пипеткой берут 10 мл, что соответствует 1 г почвы, и засевают во флаконы с 50 мл среды Кесслер. Затем из каждого разведения почвы засевают по 1 мл в пробирки с поплавками, содержащими 9 мл той же среды. Посевы выращивают в термостате 24 ч при 37⁰ С.

Второй день исследования

Просматривают посевы (при задержке роста посевы оставляют на третьи сутки). Отсутствие газообразования и помутнения в бродильных сосудах со средой Кесслер через 48 ч позволяет дать отрицательный ответ.

При наличии в средах газообразования и помутнения или только помутнения из этих сосудов производят высев петлей на сектора среды Эндо в чашках Петри. Чашки с посевами инкубируют в термостате при 37С 24 часа.

Третий день исследования

Просматривают посевы. Отсутствие роста на среде Эндо дает право на отрицательный ответ.

Если на среде Эндо вырастают типичные для кишечной палочки колонии, то из них делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При выявлении в мазках грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу. Если проба на оксидазу отрицательная, то проверяют ферментативные свойства выделенной культуры путем посева на полужидкую среду с глюкозой. Посевы помещают в термостат на 24 часа при 37⁰С.

Четвертый день исследования

Просматривают посевы. Появление в среде кислоты и газа подтверждает наличие кишечной палочки в исследуемом разведении почвы.

Коли-титр почвы определяют по наименьшему объему, в котором обнаруживают БГКП.

МЕТОД МЕМБРАННЫХ ФИЛЬТРОВ

Метод мембранных фильтров применяют при исследовании малозагрязненных почв. Через стерильные мембранные фильтры №3 пропускают по 10 мл почвенной взвеси из разведений 1:10, 1:100, 1:1000. Дальнейший ход исследования аналогичен определению кишечных палочек в воде. Метод мембранных фильтров позволяет сократить срок исследования до двух суток. Результаты анализа выражают коли-индексом. Коли-индекс почвы -это количество кишечных палочек в 1 г почвы.

Примечание. Среда Кесслер содержит лактозу, которую сбраживают БГКП, и генциановый фиолетовый, задерживающий рост грамположительной микрофлоры.

Определение титра С. perfringens

Из всех приготовленных почвенных разведений (от 1:10, до 1:1 000 000) по 1 мл вносят в два параллельных ряда стерильных пробирок. Один ряд пробирок прогревают при 80⁰ С 15 мин для освобождения от неспороносной микрофлоры. Затем во все пробирки наливают по 9 мл расплавленной и остуженной до 45⁰ С среды Вильсона-Блера, приготовленной ex tempore. Пробирки вращают между ладонями, чтобы посевной материал равномерно распределился в питательной среде, и быстро опускают их в холодную воду для удаления кислорода и охлаждения среды. Посевы выращивают при 43⁰ С 24 часа.

С. Perfringens дает рост в глубине среды в виде черных колоний. Газообразование регистрируется по разрыву питательной среды. Вмазках, приготовленных из колоний, обнаруживают грамположительные крупные палочки со спорами овальной формы, расположенные центрально или субтерминально.

Предельное разведение почвенной взвеси, которое дает на среде Вильсона-Блера рост С. perfringens, означает титр этого микроба в почве. Наличие в почве С. perfringens является косвенным показателем присутствия в ней и других клостридий - возбудителя столбняка (C. Tetani), возбудителя ботулизма (C. Botulinum). В почве определяют также количество термофильных бактерий в 1 г. Почва, в которой много кишечных палочек и мало термофилов, может рассматриваться как загрязненная фекалиями.

Питательные среды

Среда Кесслер. К 1 л дистиллированной воды добавляют 10 г пептонна, 50 мл бычьей желчи. Смесь кипятят 20 – 30 мин, фильтруют через вату, прибавляют 10 г лактозы и доводят объем до 1 л. устанавливают рН 7,4 – 7,6. Добавляют 4 мл 1% водного раствора генцианового фиолетового. Среду разливают в колбы и пробирки с поплавками. Стерилизуют 15 мин при давлении 0,5 атм (112⁰ С). Среда имеет фиолетовый цвет.

Подведение итогов лабораторных исследований почвы.

Задача: в результате исследования пробы почвы получены следующие показатели.

Общее количество бактерий в 1 г почвы 10.000

Коли-титр - 1 и выше

Титр С. perfringens – 0,01 и выше. Дать заключение и сделать выводы.