Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)

В начале 1970-х годов ученый Хьеллю Клеппе предположил, что можно амплифицировать ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК - синтетических праймеров.

Хьеллю Клеппе

В 1983 году Кэри Мюллис предложил метод, ставший в дальнейшем известным как полимеразная цепная реакция.

В 1993 году Мюллис получил Нобелевскую премию.

Кэри Мюллис

В 1965 году Томас Брок и Гудзон Фриз обнаружили уникальные микроорганизмы, живущие в гейзерах с температурой почти 88 ℃ .

Термальный источник, Йеллоустон

Томас Брок

Thermus aquaticus – экстремально термофильная бактерия, ферменты которой вошли в основу технологии ПЦР.

Микрография бактерии Thermus aquaticus

Taq-полимераза

Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) - экспериментальный метод, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Примеры применения ПЦР в различных областях

Биологические науки

(генетика, молекулярная биология, селекция, генная инженерия и т.д.)

Медицина

• Увеличение числа копий нужного фрагмента ДНК.
• Поиск нужного фрагмента ДНК.
• Клонирование генов.
• Секвенирование ДНК (определение нуклеотидной последовательности).
• Направленный мутагенез ДНК.
• Установление эволюционного родства исследуемых организмов.

Криминалистика

• Диагностика инфекций.
• Диагностика генетических заболеваний, включая пренатальную диагностику.
• Персонализированная медицина .
• Установление отцовства.

• Установление личности.

Стадии метода ПЦР

• Выделение ДНК
• Амплификация
• Детекция результатов

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК

Методика получения чистого препарата ДНК

Метод выделения ДНК, предложенный Boom

Состав смеси для ПЦР

( ПЦР-буфер)

MgCl2

ПЦР-пробирки

Праймер - искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 п.н., идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. У праймеров есть 3ˊ- и 5ˊ-концы.

Праймер служит затравкой для ДНК-полимеразы подобно РНК-затравке в естественном процессе репликации.

Для ПЦР нужно два праймера – прямой и обратный.

Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

3`

5`

5`

3`

В идеале праймеры должны соответствовать следующим критериям:

• температуры плавления двух праймеров не должны различаться более чем на 5 °С;

• ГЦ-состав их должен уложиться в интервал 40–60%;

• в структуре олигонуклеотидов не должно быть шпилек;

• праймеры не должны образовывать дуплексы (спариваться) друг с другом.

Еще лучше, если на 3ˊ-конце праймера будет гуанин или цитозин: что делает комплекс праймер-матрица более стабильным.

ДНК-полимеразы, применяемые в методе ПЦР:

• Thermus aquaticus (Taq-полимераза).
• Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза).
• Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза).

САМАЯ ПРОИЗВОДИТЕЛЬНАЯ

БОЛЕЕ ТОЧНЫЕ

• Относятся к ДНК-полимеразам I.
• Оптимум работы при +75-80°С (+70-90°С), скорость синтеза 60-150 п.н./с.
• Эффективная работа требует наличия ионов Mg.
• Синтез производится только по матрице, не может начаться без праймера и идёт всегда в направлении 5’- 3’.
• Также требуются dNTP как источники нуклеотидов.

Амплификатор - прибор, обеспечивающий периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C.

АМПЛИФИКАЦИЯ

Амплификация - основной этап ПЦР, состоящий из 20-40 циклов. Каждый цикл протекает по одной и той же схеме и состоит из трех стадий :

• Денатурация (плавление) ~ 90-98 °С.
• Отжиг (гибридизация) праймеров ~ 50-67 °С.
• Элонгация (синтез) ~ 72°С.

Каждая стадия протекает при строго определенной температуре.

Схематическое изображение температурного режима в течение первых двух циклов ПЦР.

Результатом циклического процесса является экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента ДНК, которое можно описать формулой:

А = М*(2n- n-1)~2n ,

где А – количество специфических (ограниченных праймерами) продуктов реакции амплификации;

М – начальное количество ДНК-мишеней;

n – число циклов амплификации.

Фактическое количество специфических продуктов амплификации лучше описывает формула:

А = М*(1+Е)n,

где Е – значение эффективности реакции.

Таким образом, специфические фрагменты, ограниченные на концах праймерами, впервые появляются в конце второго цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации.

«Эффект плато»

Процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической

прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность критически

падает – проявляется «эффект плато».

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)