Микробиологические исследования воды

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

ЛУГАНСКОЙ НАРОДНОЙ РЕСПУБЛИКИ

Стахановский филиал ГОСУДАРСТВЕННОГО УЧРЕЖДЕНИЯ ЛУГАНСКОЙ

НАРОДНОЙ РЕСПУБЛИКИ «ЛУГАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ СВЯТИТЕЛЯ ЛУКИ»

«Стахановский медицинский колледж»

(СтФ ГУ ЛНР «ЛГМУ ИМ.СВЯТИТЕЛЯ ЛУКИ» «Стахановский МК»)

Алгоритм лабораторных микробиологических исследований воды.

Учебное пособие для организации аудиторной и внеаудиторной самостоятельной работы по МДК 04.01 Проведение лабораторных микробиологических исследований

Специальность 31.02.03 Лабораторная диагностика

Стаханов 2022

Пояснительная записка

Один из основных принципов здравоохранения является профилактика, еще Н.И. Пирогов говорил: «Будущее принадлежит медицине предупредительной».

Основной задачей санитарной микробиологии является предупреждение возникновения инфекционных заболеваний, что достигается изучением экологии микроорганизмов, разработкой практических мероприятий по организации борьбы с инфекционными заболеваниями.

Для этого необходимо выделить патогенные микроорганизмы внешней среды: воды, почвы, воздуха.

Занимается этим бактериологическая лаборатория санитарной станции.

Работу по исследованию выполняют фельдшера лаборанты под руководством врача бактериолога.

Для проведения санитарно-микробиологических исследований существуют специальные государственные стандарты – ГОСТы, или методические указания по выполнению исследований из окружающей среды.

В данной работе представлены алгоритмы исследований воздуха, воды и смывов почвы, т.е. поэтапное определение патогенных возбудителей в воздухе, воде и смывов почвы.

Это облегчает работу по проведению исследований. Выделение чистой культуры кишечной и воздушно-капельной групп студенты изучили на предыдущих курсах по МДК 04.01.

Изучая санитарную бактериологию, студенты используют полученные раньше знания, для исследования воды, почвы, смывов, воздуха и работают по алгоритму исследования воды, почвы, смывов и воздуха.

Тема «Санитарная бактериология воды»

Санитарная бактериология занимается изучением микроорганизмов и процессов ими вызываемых в окружающей среде (вода, почва, воздух, пищевые продукты). Человек, живущий в окружающей среде, является неотъемлемой частью этих процессов, так как именно в его организме могут проходить процессы жизнедеятельности микроорганизмов и вызывать патологические изменения, то есть заболевания. Поэтому существует санитарная бактериология воды, почвы, воздуха, пищевых продуктов.

Цель занятия: Основной задачей санитарной микробиологии является предупреждение возникновения инфекционных заболеваний, что достигается изучением экологии микроорганизмов, разработкой практических мероприятий по борьбе с инфекционными болезнями.

Непосредственное выявление патогенных микроорганизмов во внешней среде представляет значительные трудности, так как они встречаются в ней постоянно и в малых количествах. Поэтому пользуются косвенными показателями зараженности окружающей среды – выявлением санитарно-показательных микроорганизмов.

Санитарно-показательными микроорганизмами являются постоянные обитатели поверхностей и полостей тела человека и животных, выделяющиеся з организма теми же путями, что и патогенные микроорганизмы. Поэтому, чем больше выявлено санитарно-показательных микроорганизмов, тем большая вероятность попадания в объекты внешней среды патогенных микроорганизмов.

Для каждого объекта внешней среды имеются определенные санитарно-показательные микроорганизмы – критерии оценки по бактериологическим показателям. Например, в отношении кишечных инфекций роль таких индикаторов принадлежит кишечным палочкам – постоянным обитателям кишечника человека и животных.

Для проведения санитарно-микробиологических исследований существуют специальные государственные общесоюзные стандарты – ГОСТы или методические указания, которые позволяют дать оценку соответствия выявленной в окружающей среде микрофлоры гигиеническим требованиям.

ГОСТы или методические указания предусматривают:

1. Правила отбора проб.

2. Количество взятого материала.

3. Условия транспортировки.

4. Методы исследования.

5. Цель исследования.

6. Критерии оценки полученных результатов.

К каждой отобранной пробе прилагают сопроводительный документ с указанием:

1. Название пробы (вода, почва, пищевые продукты и т. д).

2. Место взятия пробы и номер.

3. Дата (число, месяц, год, время).

4. Цель исследования.

5. Куда направляется проба для исследования.

6. Подпись лица, взявшего пробу.

Примечание. В некоторых случаях, например при исследовании водных источников, почвы, отмечают метеорологические условия в момент взятия пробы.

Транспортировка отобранных проб всегда производится при температуре не выше 6 – 8⁰ С, чтобы не было размножения и гибели микроорганизмов. Такую температуру поддерживают с помощью резиновых мешков, зимой наполненных теплой водой, летом – льдом. Для перевозки и хранения взятых проб лучше пользоваться сумками-холодильниками или контейнерами со льдом.

В лаборатории полученные пробы регистрируют в журналах. Бактериологическое исследование должно проводиться не позднее 3 – 6 часов от момента взятия материала.

САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ

ИССЛЕДОВАНИЕ ВОДЫ

Исследованию подлежит вода:

1. централизованного водоснабжения;

2. из колодцев различного типа;

3. открытых водоемов (рек, озер, морей);

4. плавательных бассейнов;

5. сточных вод.

Примечание. Пробы хлорированной воды берут во флаконы с дехлоратором (гипосульфитом).

Эмпирическая таблица ГОСТ 16963 – 73

Отбор проб воды. Из открытых водоемов воду берут с помощью специальных бутылей или батометров, снабженных грузилами. Пробу воды рекомендуют брать на глубине 10 – 15 см от поверхности (так как поверхность подвергается воздействию атмосферных факторов) и на расстоянии 1,5 м от берега (вода у самого берега может быть загрязнена микрофлорой почвы).

Для отбора проб водопроводной воды используют стерильные флаконы вместимостью 500 мл, закрытые ватно-марлевыми пробками и покрытые бумажными колпачками.

Кран предварительно обжигают тампоном, смоченным спиртом, после чего воду спускают в течение 10 – 15 мин и набирают во флаконы. Заполненные флаконы закрывают стерильными пробками.

В распределительной сети водопровода отбор проб воды осуществляют в зависимости от количества населения, проживающего в зоне обслуживания.

Стандартные методы исследования регламентированы для воды центрального водоснабжения (ГОСТ 18963 – 73) и предусматривают:

1. Определение общего числа микроорганизмов (в 1 мл исследуемой воды должно быть не более 100).

2. Определение коли индекса и коли титра (коли индекс 3, коли титр 333 и выше)

3. Исследование по эпидемиологическим показаниям на патогенную микрофлору (патогенных микроорганизмов не должно быть обнаружено).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО ЧИСЛА БАКТЕРИЙ

Согласно ГОСТу 18963 – 73 общее число бактерий – это количество микроорганизмов, которое содержится в 1 мл исследуемой воды, способных в течение суток при температуре 37⁰С образовывать колонии, видимые невооруженным глазом (или при увеличении с помощью лупы).

Первый день исследования.

При исследовании водопроводной воды засевают 2 чашки. В одну из них вносят 1 мл неразведенной воды, в другую 1 мл воды, разведенной в 10 раз

(т. е. 0,1 мл исходной пробы).

При исследовании более загрязненной воды засевают 1 мл воды, разведенной в 100 раз. Это соответствует 0,01 и 1 мл воды, разведенной в 1000 раз (0,001 мл) и т. д. Для получения таких объемов готовят последовательно десятикратные разведения, по 1 мл каждого разведения вносят в чашку и заливают тонким слоем (12 – 15 мл) растопленного и остуженного до 45⁰С градусов питательного агара. Для равномерного распределения исследуемой воды залитые агаром чашки перемешивают путем вращения их. После застывания агара посевы ставят в термостат и инкубируют при температуре 37⁰С 24 часа.

Второй день исследования.

Чашки с посевами вынимают из термостата и подсчитывают число выросших колоний. Учитывают только те чашки, где число колоний находится в пределах 30 – 300. Если колоний немного, их подсчитывают невооруженным глазом или при помощи лупы. Если колоний много, то подсчет можно вести с помощью специального прибора для счета микробных колоний. Подсчитанное количество колоний умножают на разведение и узнают число микробов в 1 мл исследуемой воды.

Определение БГКП

Наличие БГКП (бактерий группы кишечной палочки) является показателем фекального загрязнения, интенсивность которого характеризуют:

Коли индекс – количество кишечных палочек, обнаруженных в 1 л воды.

Коли титр – наименьшее количество воды, в котором обнаруживают присутствие кишечной палочки.

Для выявления в воде БГКП можно пользоваться двумя методами: титрационным (бродильным) и методом мембранных фильтров.

Титрационный метод.

Для исследования воды используют среду накопления – глюкозопептонную (ГПС) среду Эйкмана с индикатором и бродильными трубками. Среда готовится концентрированной (в 10 раз) и нормальной концентрации – для посева 1 мл воды.

Первый день исследования.

Исследуемую воду засевают по 100 мл в 3 колбы, по 10 мл в 3 пробирки (с концентрированной средой) и по 1 мл в 3 пробирки (со средой нормальной концентрации) – всего 333 мл. Посевы инкубируют в термостате при 37⁰С градусах 24 часа.

Второй день исследования.

Вынимают посевы из термостата и просматривают их. При наличии помутнения в колбах или пробирках из них производят посев петлей на сектора среды Эндо в чашках Петри. Посевы инкубируют в термостате при 37⁰С градусах.

Третий день исследования.

Вынимают чашки из термостата. Из подозрительных колоний делают мазки. При наличии грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазную активность. Положительная проба на оксидазу дает право дать отрицательный ответ.

Проба на оксидазу. 1 способ: со среды Эндо снимают петлей 2 – 3 колонии каждого типа и наносят на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной диметилпарафенилендиамином. Положительная реакция характеризуется посинением штрихов. сделанных из колоний. 2 способ: реактив можно нанести на изолированную колонию на среде Эндо (красная колония – синеет).

Отрицательная проба на оксидазу свидетельствует о наличии в воде БГКП. В этом случае вычисляют коли индекс и коли титр с помощью стандартных (эмпирических) таблиц ГОСТа 16963 – 73. Эти таблицы предусматривают любую возможную комбинацию объемов посев, из которых выделена кишечная палочка.

Метод мембранных фильтров

Для фильтрации воды можно использовать воронку Гольдмана вместимостью 700 – 800 мл.

Первый день исследования.

В воронку смонтированного и простерилизованного фильтровального прибора Зейтца наливают отмеренный объем исследуемой воды. С помощью насоса создают вакуум в приемном сосуде (обычно воду фильтруют через фильтры № 2 и 3). По окончании фильтрации стерильным или обожженным в огне пинцетом снимают фильтр и накладывают его на среду Эндо в чашке Петри так, чтобы поверхность с осевшими на ней микробами была обращена вверх (на одну чашку можно помещать 3 – 4 мембранных фильтра).

Посевы инкубируют в термостате при температуре 37⁰С 18 – 24 часа.

Второй день исследования.

Чашки с посевами (фильтрами) вынимают из термостата. Отсутствие подозрительных колоний дает право дать отрицательный ответ.

Учету подлежат все красные и розовые колонии с металлическим блеском или без него. Из выросших колоний делают мазки, окрашивают по Граму.

При наличии грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу. Положительная оксидазная проба дает право дать отрицательный ответ. При отрицательной оксидазной пробе производят посев на полужидкую среду с глюкозой и индикатором или на среду ГПС с бродильными трубками – для выявления ферментации углевода до кислоты и газа. При наличии кислоты и газа вычисляют коли индекс. Например, на всех фильтрах, находящихся на среде Эндо, выросло 3 колонии, пропущено через фильтр было 300 мл воды.

Расчет: 300 мл – 3 колонии

1000 мл – х

х = 10; коли индекс 10

Примечание. Традиционный метод более точный и может быть использован при наличии в воде примесей. Метод мембранных фильтров экономичнее и дает возможность дать ответ на 2-й день.

Выявление свежего фекального загрязнения.

Для определения наличия в воде свежих фекальных кишечных палочек производят посев воды (3-х объемов) на лактозопептонную среду с борной кислотой. Инкубируют при 43⁰С 24 часа. Наличие кислот и газа свидетельствует о свежем фекальном загрязнении.

По эпидемиологическим показаниям в воде определяют сальмонеллы, шигеллы, энтеровирусы.

Примечание. Общепринятым дополнительным показателем фекального загрязнения питьевой воды являются энтерококки. При проведении бактериологического исследования определяют все группы энтерококков, хотя санитарное значение имеют преимущественно фекальные стрептококки, обнаружение которых является показателем свежего фекального загрязнения.

Питательные среды.

ГПС (Эйкмана) концентрированная. В 1л воды растворяют 100 г пептона, 50 г хлорида натрия. Нагревают смесь до кипения, фильтруют, прибавляют 100 г глюкозы, устанавливают рН 7,4 – 7,6 и разливают по 10 мл в колбы вместимостью 250 мл, по 1 мл в 3 пробирки (концентрированной среды) и по 1 мл в 3 пробирки со средой нормальной концентрации (во всех емкостях среду до нужной концентрации доводят стерильной водой).

Подведение итогов лабораторных исследований:

Задача: в результате исследования пробы воды из скважины получены данные микробиологического исследования 150; коли индекс – 6, коли титр 666 мл.

Дать заключение и рекомендации.

Задача: в результате исследования пробы водопроводной воды получили данные: микробное число – 100, коли индекс – 3, коли титр – 333.

Дать заключение и рекомендации.