Алгоритмы исследования пищевых продуктов

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

ЛУГАНСКОЙ НАРОДНОЙ РЕСПУБЛИКИ

Стахановский филиал ГОСУДАРСТВЕННОГО УЧРЕЖДЕНИЯ ЛУГАНСКОЙ

НАРОДНОЙ РЕСПУБЛИКИ «ЛУГАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ СВЯТИТЕЛЯ ЛУКИ»

«Стахановский медицинский колледж»

(СтФ ГУ ЛНР «ЛГМУ ИМ.СВЯТИТЕЛЯ ЛУКИ» «Стахановский МК»)

Алгоритм лабораторных микробиологических исследований пищевых продуктов.

Учебное пособие для организации аудиторной и внеаудиторной самостоятельной работы по МДК 04.01 Проведение лабораторных микробиологических исследований

Специальность 31.02.03 Лабораторная диагностика

Стаханов 2022

Пояснительная записка

Исследование пищевых продуктов: молока и молочных продуктов, крема и изделий из крема, колбасных и мясных изделий, баночных консервов.

Продукты являются фактором передачи пищевых токсикоинфекций. Пищевые продукты – это благоприятная среда для размножения микроорганизмов, таких как кишечная палочка, стафилококки, стрептококки и других.

Для выполнения исследования пробы согласно ГОСТу для определения БГКГ; общего числа бактерий, стафилококков, сальмонелл и других микроорганизмов исследования проводят согласно схемам, изученным раннее по определению кишечной палочки, стафилококка, сальмонелл, стрептококков.

Данные алгоритмы помогают быстро и качественно провести выделение чистой культуры, что очень важно для разработки противоэпидемических мероприятий в очаге заболевания.

Тема «Санитарная бактериология

пищевых продуктов»

Санитарная бактериология занимается изучением микроорганизмов и процессов ими вызываемых в окружающей среде (вода, почва, воздух, пищевые продукты). Человек, живущий в окружающей среде, является неотъемлемой частью этих процессов, так как именно в его организме могут проходить процессы жизнедеятельности микроорганизмов и вызывать патологические изменения, то есть заболевания. Поэтому существует санитарная бактериология воды, почвы, воздуха, пищевых продуктов.

Цель занятия: Основной задачей санитарной микробиологии является предупреждение возникновения инфекционных заболеваний, что достигается изучением экологии микроорганизмов, разработкой практических мероприятий по борьбе с инфекционными болезнями.

Непосредственное выявление патогенных микроорганизмов во внешней среде представляет значительные трудности, так как они встречаются в ней постоянно и в малых количествах. Поэтому пользуются косвенными показателями зараженности окружающей среды – выявлением санитарно-показательных микроорганизмов.

Санитарно-показательными микроорганизмами являются постоянные обитатели поверхностей и полостей тела человека и животных, выделяющиеся з организма теми же путями, что и патогенные микроорганизмы. Поэтому, чем больше выявлено санитарно-показательных микроорганизмов, тем большая вероятность попадания в объекты внешней среды патогенных микроорганизмов.

Для каждого объекта внешней среды имеются определенные санитарно-показательные микроорганизмы – критерии оценки по бактериологическим показателям. Например, в отношении кишечных инфекций роль таких индикаторов принадлежит кишечным палочкам – постоянным обитателям кишечника человека и животных.

Для проведения санитарно-микробиологических исследований существуют специальные государственные общесоюзные стандарты – ГОСТы или методические указания, которые позволяют дать оценку соответствия выявленной в окружающей среде микрофлоры гигиеническим требованиям.

ГОСТы или методические указания предусматривают:

1. Правила отбора проб.

2. Количество взятого материала.

3. Условия транспортировки.

4. Методы исследования.

5. Цель исследования.

6. Критерии оценки полученных результатов.

К каждой отобранной пробе прилагают сопроводительный документ с указанием:

1. Название пробы (вода, почва, пищевые продукты и т. д).

2. Место взятия пробы и номер.

3. Дата (число, месяц, год, время).

4. Цель исследования.

5. Куда направляется проба для исследования.

6. Подпись лица, взявшего пробу.

Примечание. В некоторых случаях, например, при исследовании водных источников, почвы, отмечают метеорологические условия в момент взятия пробы.

Транспортировка отобранных проб всегда производится при температуре не выше 6 – 8⁰ С, чтобы не было размножения и гибели микроорганизмов. Такую температуру поддерживают с помощью резиновых мешков, зимой наполненных теплой водой, летом – льдом. Для перевозки и хранения взятых проб лучше пользоваться сумками-холодильниками или контейнерами со льдом.

В лаборатории полученные пробы регистрируют в журналах. Бактериологическое исследование должно проводиться не позднее 3 – 6 часов от момента взятия материала.

САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛОКА И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ

Алгоритм исследования.

Молоко и молочные продукты являются благоприятной средой для размножения микроорганизмов.

При изготовлении некоторых молочных продуктов: творога, кефира, простокваши, ряженки и других используют специальную микрофлору, например молочно-кислые стрептококки, молочно-кислые ацидофильные палочки и др. Микрофлора, используемая для приготовления этих продуктов, является для них специфичной и не учитывается.

Неспецифической микрофлорой, встречающейся в молоке и молочных продуктах, являются аэробные бактерии: БГКП, стафилококки и др.

С молоком могут передаваться возбудители туберкулеза, сальмонеллеза, сибирской язвы, вирус полиомиелита, анаэробные бациллы и т. д.

Обсеменение молока и молочных изделий неспецифической микрофлорой может произойти в момент удоя, транспортировки, хранения и т. д.

Исследование молока и молочных продуктов проводят согласно ГОСТу 9225 – 68.

ОТБОР ПРОБ.

Пробы жидких и полужидких продуктов после тщательного их перемешивания отбирают в количестве 50 - 100 мл в стерильные колбы. Пробы сливочного масла, сыра, творога отбирают с помощью стерильного щупа из глубины продукта. Перед взятием пробы масла, творога верхний слой продукта тщательно зачищают, а поверхность сыра в месте отбора пробы прижигают раскаленным ножом. Из расфасованных продуктов берут по 2 образца в оригинальной упаковке. Взятые образцы сопровождают документом, в котором указывают:

1. Номер образца.

2. Наименование и сорт продукта.

3. Дату изготовления.

4. Дату и час отбора пробы.

5. Объем необходимых исследований.

6. Должность и подпись лица, отобравшего пробу.

Микробиологическое исследование продукта должно производиться не позднее чем через 4 часа с момента отбора пробы. При транспортировке температура не должна превышать 6⁰С.

ГОСТ для молока и молочных изделий предусматривает определение общего числа бактерий в 1 г (мл) и определение титра цитратотрицательных (цитратнегативных) разновидностей БГКП (коли-титр).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО ЧИСЛА БАКТЕРИЙ

Подготовка образцов для исследования. Из молока и других молочных продуктов готовят десятикратные разведения (по общепринятой методике). Количество разведений для каждого вида продукта готовят с учетом наиболее вероятного микробного обсеменения.

Посев. По 1 мл каждого разведения вносят в 2 – 3 стерильные чашки Петри и заливают 12 – 15 мл растопленного и остуженного до 45⁰ С питательного агара. Предварительно чашки маркируют. Сразу после заливки содержимое чашки перемешивают (путем легкого вращательного покачивания) для равномерного распределения посеянного материала. Посевы ставят в термостат при 37⁰С на 48 часов.

Таблица 1. Разведения молока и молочных продуктов.

Примечание. Для определения общего количества бактерий следует выбирать те разведения, при посевах которых на чашках вырастает не менее 50 и не более 300 колоний.

По истечении срока инкубации чашки вынимают и подсчитывают число колоний, выросших на каждой чашке, умножают на соответствующее разведение. Полученные результаты по отдельным чашкам складывают, делят количество чашек и получают среднее арифметическое, которое является показателем общего числа бактерий в 1 г (мл).

Соответствующие госты регламентируют качество продуктов, что устанавливают по допустимым показателям: общему числу микробов и коли-титру. Пример для двух видов продуктов представлен в таблице 2.

В кисломолочных продуктах (кефир, простокваша, творог, сметана и др.), содержащих обильную специфическую микрофлору, общее количество бактерий не определяют, а контролируют состав микрофлоры. Для этого из кисломолочных продуктов готовят препараты и красят метиленовым синим. В поле зрения препарата должны находиться только специфические для данного продукта микроорганизмы. Например, для простокваши – молочно-кислые стрептококки и палочки; для кефира – молочно-кислые стрептококки и палочки, единичные дрожжи. Микроскопия позволяет выявить микроорганизмы порчи (плесени и большое количество дрожжей).

Таблица 2. Показатели общего числа бактерий и коли-титра в молоке.

Примечание. Для других молочных продуктов также имеется ГОСТ обусловливающий допустимое количество микробов в 1 мл (г) продукта. Буквы А и Б обозначают категорию продукта.

Определение БГКП

Обсемененность молока и молочных продуктов бактериями группы кишечной палочки определяют бродильным методом. Бродильный титр – это то наименьшее количество продуктов, выраженное в граммах или миллилитрах, в котором присутствует кишечная палочка. Согласно ГОСТу 9225 – 68 учитываются только цитратнегативные разновидности кишечной палочки.

БРОДИЛЬНЫЙ МЕТОД.

Первый день исследования

Посев молока и молочно-кислых продуктов производят в 6 пробирок с 5 мл среды Кесслер. В 3 пробирки по 1 мл из разведения 1:10 (0,1 мл). Посевы инкубируют в термостате при 43⁰С 18 – 24 ч.

Второй день исследования

Из каждой забродившей пробирки производят посев на сектор среды Эндо и инкубируют при 37⁰С 18 – 24 ч.

Третий день исследования

При отсутствии типичных для БГКП колоний продукт считают незагрязненным кишечной палочкой.

При наличии типичных для БГКП колоний делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При обнаружении грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу и производят посев на среду с глюкозой и среду Козера.

Четвертый день исследования

Производят учет результатов. Наличие кислоты и газа на среде с глюкозой и отсутствие роста на среде Козера свидетельствует о наличии цитратнегативных разновидностей кишечной палочки. Коли-титр вычисляют по таблице 3.

Таблица 3. Вычисление коли-титра в пастеризованном молоке, сливках, кефире, простокваше, ацидофильном молоке.

Примечание. Вычисление кои-титра для масла, сыра, творожных изделий, мороженого и молочных консервов проводят по другим таблицам, указанным в ГОСТе.

Присутствие патогенных микроорганизмов в молоке и молочных продуктах недопустимо.

САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ

ИССЛЕДОВАНИЕ КРЕМА И ИЗДЕЛИЙ ИЗ КРЕМА

Алгоритм исследования.

ОТБОР ПРОБ

Пробы крема берут с поверхности и из прослойки. Пробу снимают стерильной ложкой в количестве 50 г и помещают в стерильную стеклянную посуду.

Первый день исследования

Собранный материал ставят в термостат или водяную баню при температуре не выше 43 – 45⁰ С. Для исследования используют нижнюю часть растопленного крема.

Из исследуемого материала делают 3 десятикратных разведения: 1:10, 1:100,1:1000.

10 мл разведения 1:10 засевают в колбу с 50 мл среды Кесслер. Остальные разведения (1:100 и 1:1000) засевают по 1 мл в 5 мл среды Кесслер в пробирках. Посевы ставят в термостат при температуре 43⁰ С на 24 часа.

Второй день исследования

Из всех посевов со средой Кесслер производят высев на сектора чашки Петри со средой Эндо и ставят в термостат при температуре 37⁰С на 24 часа.

Третий день исследования

При отсутствии подозрительных колоний дают отрицательный ответ.

Из колоний, подозрительных в отношении кишечной палочки, делают мазки, окрашивают его по Граму. При наличии грамотрицательных палочек вычисляют коли-титр. Титр БГКП должен быть не ниже 0,3 г.

ВЫЯВЛЕНИЕ КОАГУЛАЗОПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ СТАФИЛОКОККОВ

Первый день исследования

0,1 г растопленного крема засевают на молочно-солевой агар и ставят в термостат при температуре 37⁰С на 24 часа. Параллельно по 0,5 мл засевают в 2 пробирки с 5 мл 6,5 – 10% солевого бульона (среда накопления) с последующим пересевом на желточно-солевой агар.

Второй день исследования

Просматривают посевы. При наличии роста чашки с посевами оставляют при комнатной температуре на 24 час для выявления пигмента. Со среды накопления производят посев на желточно-солевой агар. Инкубируют при 37⁰С 18- 24 часа.

Третий день исследования

Изучают выросшие на чашках колонии. Подозрительные в отношении стафилококков колонии изучают: определяют фермент коагулазу.

Коагулазоположительных стафилококков не должно быть более 500 в 1г/мл.

Мясо и мясные продукты могут быть обсеменены различными микроорганизмами. Пути инфицирования мяса:

1. обсеменение мяса бывает первичным (прижизненно) в результате ослабления организма животного (голод, травма), т.е. при состоянии, когда нарушаются барьерные функции кишечника, и микробы из него попадают в органы и кровь;

2. микробы могут обсеменять мясо, распространяясь по организму, при заболеваниях животных, например сальмонеллезом;

3. микроорганизмы могут попасть в мясо при забое животных и разделке туш (наиболее частый случай).

Мясные продукты инфицируются при недостаточно строгом соблюдении технологического режима изготовления, нарушения режима хранения и пр.

Колбасные изделия и продукты из мяса промышленного производства исследуют в соответствии с ГОСТом 9958 – 74, который регламентирует определение:

1. общего числа бактерий в 1 г продукта;

2. присутствия бактерий группы кишечной палочки в 1 г;

3. сальмонелл в 5 г продукта, а также протеев и клостридий.

ОТБОР ПРОБ

От каждой партии колбасных изделий отбирают не менее двух проб из разных мест. Из них составляют общую пробу, которую исследуют. Из сосисок, сарделек составляют общую пробу из нескольких экземпляров. Из таких продуктов как холодец, паштет и других продуктов без оболочки пробы берут из 2 – 3 мест в количестве 200 – 250 г каждая.

Общие пробы каждого продукта упаковывают отдельно в стерильный пергамент. Все взятые пробы пломбируют, этикетируют.

В этикетке пишут:

1. Название продукта.

2. Время взятия (дата, час).

3. Место взятия.

4. Цель исследования.

5. Куда направлен материал.

6. Подпись лица, взявшего пробу.

Примечание! Транспортировать продукты следует при температуре не выше 6 – 8⁰С, а исследование производить не позднее чем через 4 часа с момента отбора пробы.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА МИКРОБОВ

в 1 г продукта

Первый день исследования

Из каждого исследуемого образца производят 2 посева по 0,1 и 0,01 г. Для этого делают 2 десятикратных разведения и по 1 мл каждого вносят в 2 – 3 стерильные чашки Петри. Засеянные чашки заливают 12 – 15 мл расплавленного и остуженного до 45⁰С агара. После застывания агара на него наливают 4 – 5 мл голодного агара – для предотвращения роста протея. Посевы инкубируют при 37⁰С 48 часов.

Второй день исследования

Чашки вынимают из термостата, подсчитывают количество выросших колоний и умножают на сделанные разведения. Определив число бактерий в 1 г продукта, сопоставляют с ГОСТом.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БГКП

в 1 г продукта

Определение основано на способности бактерий кишечной группы ферментировать маннит с образованием кислых продуктов, изменяющих цвет индикатора в среде «ХБ» и Хейфеца (двойной концентрации), и расщеплять глюкозу с образованием кислоты и газа (в среде Кесслер с поплавками).

Первый день исследования

В каждую из вышеуказанных сред вносят по 5 мл первого и второго разведения. Посевы инкубируют при 430С в течение 18 – 20 часов.

Второй день исследования

Вынимают посевы из термостата. При наличии роста кишечных палочек среда «ХБ» и Хейфеца приобретает желтый цвет (из голубого), а на среде Кесслер образуются пузыри газа. Идентификацию выросших бактерий проводят по способу, описанному выше.

ВЫЯВЛЕНИЕ САЛЬМОНЕЛЛ

Первый день исследования

25 мл полученной взвеси засевают во флакон, содержащий 100 мл среды накопления (Мюллера, Кауфмана или селенитового бульона). Посевы инкубируют в термостате при температуре 37⁰С.

Второй день исследования

Из среды накопления производят посев на среды Эндо и висмут-сульфитный агар в чашках Петри, а дальше исследование ведут по общепринятой схеме.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕЯ

Первый день исследования

0,5 мл взвеси вносят в конденсат свежескошенного агара (метод Щукевича).

Второй день исследования

Присутствие протея определяют по наличию ползучего вуалеобразного налета (его микроскопируют и определяют подвижность).

САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ

ИССЛЕДОВАНИЕ БАНОЧНЫХ КОНСЕРВОВ

Алгоритм исследования.

Микрофлора консервов может быть представлена аэробными и анаэробными микроорганизмами, которые могут попасть в консервы при инфицировании исходного продукта либо в результате неправильной стерилизации.

ПОДГОТОВА К ИССЛЕДОВАНИЮ

Банки, подлежащие исследованию, осматривают: нет ли деформации коробки, подтеков, ржавчины. Затем определяют их герметичность и проверяют на бомбаж.

Герметичность проверяют методом погружения банок в кастрюлю с водой, нагретой до кипения. Количество воды должно в 4 раза превосходить вместимость банки, а слой воды над банками должен быть не менее 5 см. В воде банки выдерживают несколько минут. Появляющиеся пузырьки воздуха в воде говорят об отсутствии герметичности.

Проверка на бомбаж. Банки вносят в термостат и выдерживают их при температуре 37⁰С 5 – 6 дней. О наличии бомбажа судят по вздутию крышки или дна банки.

Банки с отсутствием герметичности и наличием бомбажа исследованию не подлежат (их бракуют).

Подготовка банок для бактериологического исследования. Исследование производят в боксе в асептических условиях.

В боксе должны находиться пробойники, стеклянные трубки (стерильные), питательные среды: бульон с 1% глюкозой, среда Тароцци.

Банки освобождают от этикеток, регистрируют имеющиеся на них данные и моют горячей водой с мылом, ополаскивают и насухо вытирают. Поверхность банки обжигают ватой, смоченной спиртом. Под горящую вату подводят острие профламбированного пробойника под углом 30 – 40⁰С. Пробивают отверстие и вводят в него стеклянную трубочку 8 – 9 мм в диаметре, закрытую с одной стороны ватой, и набирают в нее исследуемый материал. После взятия материала сделанное отверстие закрывается крышкой стерильной чашки Петри.

Посев. Для выявления мезофильных аэробов (ГОСТ 10.444.3.75) проводят посев 2 см³ взятых проб в 2 пробирки с 5 – 6 мл бульона с 1% глюкозой. Посевы инкубируют при 37⁰С в течение 5 дней, ежедневно наблюдая за появлением роста. При наличии роста делают мазки, окрашивают по Граму. Консервы не должны содержать аэробной флоры.

Для выявления мезофильных анаэробов (ГОСТ 10.444.4.75) по 2 см³ исследуемого продукта засевают в 2 пробирки с 10 – 13 см³ среды Тароцци, предварительно прогретой на водяной бане в течение 20 минут, и быстро охлажденной до 40⁰С. Посевы помещают в термостат при 37⁰С на 5 суток. При наличии роста со дна пробирки берут материал, делают мазки и ставят пробу на каталазу. Если в мазках обнаружены грамположительные микробы, а каталазная проба отрицательная, то 2 мл полученной культуры переносят в стерильную чашку Петри и заливают агаром с 1% глюкозы. На застывшую поверхность агара накладывают стерильное предметное стекло так, чтобы под ним не было пузырьков воздуха. Чашку в перевернутом виде инкубируют при 37⁰С 48 часов. При появлении под стеклом роста бактерий или разрывов в агаре, отступающих на 3 – 4 мм от края стекла, считают, что в посеве присутствуют анаэробы.

По санитарно-эпидемиологическим показаниям, независимо от вида консервов, проводят исследования на наличие: возбудителей коагулазоположительных стафилококков, возбудителей и токсинов ботулизма, клостридий перфрингенс, бактерий цереус, термофильных аэробов и анаэробов, дрожжей и плесеней.

Консервы не должны содержать патогенных микроорганизмов. Допускается наличие непатогенных спорообразующих микробов при нормальных органолептических качествах продукта.